Der Verdacht einer Multiplen Sklerose ergibt sich aus der Krankengeschichte und einer neurologischen Untersuchung: Dabei werden Hirnnerven auf ihre Funktion geprüft, Empfindungen, Reflexe und Muskelkraft getestet, usw. Mit Hilfe einer Skala kann der Neurologe den Grad der Behinderung einschätzen. Es folgen weitere Untersuchungen, um die Diagnose zu sichern. Eine davon ist die Untersuchung der Gehirn-Rückenmarksflüssigkeit (sog. Liquor bzw. "Hirnwasser"), die mit einer Hohlnadel im Spalt zwischen den Lendenwirbelkörpern entnommen wird. Entzündliche Veränderungen im zentralen Nervensystem lassen sich im Hirnwasser feststellen: Die gemessenen Werte für bestimmte Abwehrzellen und Antikörper sind krankhaft erhöht. Da dies auch für andere entzündliche Erkrankungen des Nervensystems gilt (z.B. die Hirnhautentzündung, Meningitis), werden zusätzlich noch andere Verfahren angewandt, um den Diagnoseverdacht zu bestätigen.
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Nervenimpulse, die als Reaktion auf einen bestimmten, vorgegebenen Seh- oder Hörreiz entstehen, lassen sich mit dem Elektro-Enzephalogramm (EEG) messen. Diese evozierten Potenziale geben Auskunft über die gestörte Leitfähigkeit in einem erkrankten Seh- oder Hörnerven. Liegt eine Multiple Sklerose vor, zeigen sich charakteristische Veränderungen. So ist die Reaktion auf z.B. Lichtblitze oder Klicklaute verzögert.

Den höchsten Stellenwert für Krankheitsnachweis sowie -verlauf besitzt die Magnetresonanztomographie (MRT). Hier sind häufig schon frühzeitig die krankhaft veränderten Entzündungsherde erkennbar, die für Multiple Sklerose charakteristisch sind, ohne dass bereits Symptome auftreten. Im Vergleich zur MRT-Untersuchung ist die Computertomographie (CT) wesentlich weniger aussagekräftig.